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經(jīng)常做細胞實驗的你，想必一定遇到過這個難題：細胞收集，究竟哪種方案＊合適？離心收集or瓶內(nèi)裂解or胰酶消化？01 細胞收集方法優(yōu)劣對比離 心 法優(yōu)點：離心法操作方便，同時我們可根據(jù)收集到的細胞沉淀來加入適量的裂解液，從而 能夠控制樣品蛋白的濃度。缺點：在離心過程中卻容易造成細胞破碎而降低總蛋白得率，同時會造成細胞外基質(zhì) （ECM）的丟失，從而造成樣品蛋白質(zhì)圖譜的不完整。注：細胞外基質(zhì)（ECM）是由細胞外大分子和礦物質(zhì)（如膠原蛋白、酶、糖蛋白和羥基 磷灰石）組成的三維網(wǎng)絡(luò)，為周圍細胞提供結(jié)構(gòu)和生化支持。因為多細胞在不同的多細胞譜 系中獨立進化，細胞外基質(zhì)的組成因多細胞結(jié)構(gòu)而異；然而，細胞粘附、細胞間通訊和分化 是ECM的常見功能。細胞外基質(zhì)主要由5類物質(zhì)組成，即膠原蛋白、非膠原蛋白、彈性蛋 白、蛋白聚糖與氨基聚糖，按分布部位劃分主要分為基底膜（Basement membrane）和間 質(zhì)基質(zhì)(Interstitial matrix)瓶 內(nèi) 裂 解 法優(yōu)點：瓶內(nèi)裂解法＊大的優(yōu)點是可以有效的防止細胞在離心過程中破碎，能有效的提高 總蛋白得率，同時也能完整的保留細胞外基質(zhì)（ECM）。缺點：操作會相對復雜，且不易控制加入的裂解液量，往往會造成總蛋白濃度低且粘度 高等情況；對于一些藥物處理的細胞和貼壁不牢的細胞，使用此方法在清洗階段也容易造成 細胞大量丟失。胰 酶 消 化 法優(yōu)點：胰酶處理的細胞個體形態(tài)單一，不聚團，對細胞損傷小。缺點：會造成細胞外基質(zhì)（ECM）的完全丟失，同時會剪切一些對胰酶敏感的蛋白，如 上圖右。對于WB蛋白樣品中是否含有對胰酶敏感的蛋白，我們往往不太確定，同時胰蛋白酶也 屬于外來蛋白質(zhì)，如果不能做到徹底清除，同樣會污染我們的樣本。所以用于WB的細胞樣 品不建議使用胰酶消化法收集細胞。離心法：適用于懸浮細胞、貼壁不牢和藥物處理過的細胞；瓶內(nèi)裂解法：適用于所有的貼壁細胞；在一般情況下，我們首推瓶內(nèi)裂解法，其次離心法；不推薦胰酶消化法。02 細胞收集protocola. 瓶內(nèi)裂解法（效果＊佳）：適用于所有的貼壁細胞1）吸凈培養(yǎng)基，用冰的PBS清洗細胞表面2遍（動作輕柔，防止細胞脫落），盡可能吸取 殘留的PBS。2）在冰上加入適量預冷的裂解液于細胞瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，用移液管吹散貼壁的細 胞，對于貼壁緊的細胞也可使用細胞刮收集，收集裂解液，在冰上放置30min，期間每10min 上下顛倒混勻一次。b. 離心法：適用于懸浮細胞、貼壁不牢和藥物處理過的細胞1）使用細胞刮收集細胞懸液（連同培養(yǎng)基一起收集），4℃，500g離心5min，收集沉 淀，沉淀用預冷的PBS洗滌兩遍，收集細胞沉淀，盡可能吸取殘留的PBS。2）加入適量的裂解液，在冰上放置30min，期間每10min上下顛倒混勻一次。注：裂解液在使用前提前加入蛋白酶抑制劑，用于磷酸化抗體檢測的需要同時加入蛋白酶 抑制劑和磷酸酶抑制劑。

細胞樣本樣品量要求：1*107 cell/sample，提供兩份樣本，其中一份作為備份，分兩管盛放。淬滅試劑準備：稱取85g AMBIC（碳酸氫銨）加入到1000ml超純水中，得到85g/l的AMBIC溶液。然后量取600ml 甲醇，100ml AMBIC (85g/l)，290ml 超純水水，混合，用12M 鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4，＊后用超純水定容至1L即可。注意：由于pH的變化，淬滅試劑＊好現(xiàn)配現(xiàn)用。懸浮細胞[1]樣本收集步驟：1. 對細胞進行計數(shù)，計算1*107個細胞所需要的體積（即1體積）；2. 取5體積的淬滅試劑于試管中（試管的體積應為大于等于7體積），置于-20℃預冷；3. 快速從細胞培養(yǎng)液中取出1體積的細胞，放入含有淬滅試劑的試管中；4. 輕微震蕩試管10s，在1000g，4℃下離心1min，若細胞較小或細胞未沉淀，可適當加大轉(zhuǎn)速或延長離心時間，但不宜一次提升太多，以防止細胞破損；5. 除去上清；6. 將細胞放入液氮，30s后取出置于-80℃保存。貼壁細胞酶消化法[2]樣本收集步驟：1. 除去細胞培養(yǎng)基，迅速用預冷的 PBS 溶液清洗細胞，清洗兩次；2. 除去 PBS 溶液（一定要將 PBS 去除干凈，越快越好）；3. 消化：加入胰酶，消化至部分細胞呈球狀；然后加入培養(yǎng)基，輕輕晃動，使培養(yǎng)基浸潤細胞終止消化，吸出剩余培養(yǎng)基；加入 PBS 吹打，懸浮細胞；（目的是把貼壁細胞消化下來，方便后繼處理，加入的溶液量及孵育時間可以根據(jù)自己實驗室具體情況進行修改）；4. 快速計數(shù)，取1*107個細胞所需要的體積（即1體積）；5. 快速放入預冷的5體積的淬滅試劑中，輕微震蕩離心管 10s；6. 轉(zhuǎn)子-20℃預冷,在 4℃，1000g 條件下離心 1min，若細胞較小或未沉淀，可適當加大轉(zhuǎn)速或延長離心時間，但不宜一次提升太多，以防止細胞破損；7. 除去上清，將細胞放入液氮中，30s 后取出保存在-80℃中。刮細胞法（針對很難用酶消化下來的貼壁細胞）[2]樣本收集步驟：1. 除去細胞培養(yǎng)基，迅速用預冷的 PBS 溶液清洗細胞，清洗兩次；2. 除去 PBS 溶液（越快越好）；（不能計數(shù)的話，建議測代謝物之前做蛋白定量）3. 加入5體積淬滅試劑淬滅后用細胞刮分離細胞，將刮下的細胞轉(zhuǎn)入離心管中；4. 在4℃，1000g 條件下離心 1min 去除上清。5. -80℃保存，干冰運輸。注意事項：1. 取對數(shù)生長期，培養(yǎng)至同一時期的細胞，建議多準備樣本，以備后續(xù)使用；2. 液氮處理細胞時，注意防止離心管破碎導致樣本受損；3. 為防止樣本收集過程中細胞膜破裂，建議在全程操作不宜過度劇烈，切勿渦旋震蕩、高速離心或超聲等，同時避免反復凍融，以保證細胞膜不會破損，減少代謝組學分析影響；4. PBS清洗時，切勿沖走細胞，清洗充分后，盡量將PBS完全倒掉。收集方法參考文獻：[1]Christopher A Sellick, Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling, nature protocol, 2011.[2]Rahul Vijay Kapoore, Cell line dependence of metabolite leakage in metabolome analyses of adherent normal and cancer cell lines, metabolomics,2015.無需淬滅劑細胞樣本收集方法（備選方法，一般不建議使用）懸浮細胞[1,2]樣本收集步驟：1. 收集細胞并記數(shù)，1*107 cell/sample。2. 將收集的細胞進行4℃離心，5min，1200rpm。3. 使用PBS洗滌細胞，并在900rpm條件下離心。重復三次，去除PBS（盡量將PBS去除干凈）4. 將含有細胞的EP管，迅速放入液氮中30s。5. 放入-80℃冰箱保存。干冰寄送。貼壁細胞刮細胞法[3]樣本收集步驟：1. 將細胞用PBS進行多次清洗。2. 用細胞刮將細胞刮入微離心管中，。3. 將EP管迅速放入液氮中30s，然后進行凍干。4. 在-80℃冰箱保存。干冰寄送。酶消化法[4]樣本收集步驟：1. 除去細胞培養(yǎng)基，迅速用預冷的 PBS 溶液清洗細胞，清洗兩次。2. 除去 PBS 溶液（一定要將 PBS 去除干凈，越快越好）。3. 消化：加入胰酶，消化至部分細胞呈球狀；然后加入培養(yǎng)基，輕輕晃動，使培養(yǎng)基浸潤細胞終止消化，吸出剩余培養(yǎng)基；加入 PBS 吹打，懸浮細胞；（目的是把貼壁細胞消化下來，方便后繼處理，加入的溶液量及孵育時間可以根據(jù)自己實驗室具體情況進行修改）。4. 快速計數(shù)，取 1 體積的細胞。5. 轉(zhuǎn)子-20℃預冷,在 4℃，2500g 條件下離心 5min。6. 去除上清，迅速放入液氮速凍30s，-80℃保存。干冰寄送。收集方法參考文獻：[1]Dehui Xu, Yujing Xu et al. Alteration of metabolite profling by cold tmospheric plasma treatment in human myeloma cells. Cancer Cell Int. 2018[2]Zuzana Racovaa, Eva Anzenbacherova,et al. Metabolite profiling of natural substances in human: in vitro study from fecal bacteria to colon carcinoma cells (Caco-2). Journal of Nutritional Biochemistry. 2020[3]Sarah Hayton, arth L. Maker et al. Experimental design and reporting standards for metabolomics tudies of mammalian cell lines. Cellular and Molecular Life Sciences. 2017[4]Katja Dettmer,Nadine Nürnberger et al. Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: optimization of harvesting and extraction protocols. Anal Bioanal Chem. 2011.細胞培養(yǎng)液樣品量要求：200μL/sample，提供兩份樣本并分 2 個離心管存放（條件允許＊好 500μL/sample）。樣本收集步驟：1．將培養(yǎng)液搖勻，快速從培養(yǎng)瓶中取出一定量的培養(yǎng)液，4℃條件下離心（1000g，10min）；2．移取上清 500μL 至新的離心管中, 迅速放入液氮中淬滅，30s；3．淬滅后放入-80℃中保存。注意事項：寄送樣本時請放入足量的干冰以保持低溫條件【經(jīng)驗值：快遞途中干冰消耗率約為 5KG/天，消耗速度與氣溫，泡沫箱厚度(>5cm)有直接關(guān)系，請酌情添加干冰】。收集方法參考文獻：[1]Silas G.Villas-Boas, Extracellular metabolomics: A metabolic footprinting approach to assess Wber degradation in complex media ，Analytical biotechnology, 2005.[2]Hanna Meyer, Hendrikje Weidmann, Methodological approaches to help unravel the intracellular metabolome of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories 2013, 12:69.[3]Farhana R. Pinu, Analysis of Intracellular Metabolites from Microorganisms: uenching and Extraction Protocols, metabolites, 2017.

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